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　　研究目的红桂木ARTOCARPUSLINGNANENSISLECTIN，ALL是一种从广西产亚热带地区特有的桂木属植物红桂木种子中分离纯化得到的性质稳定、凝集活性高的植物凝集素。本课题组前期研究发现，ALL可促进人外周血CD4T淋巴细胞的增殖和活化诱导人外周血和小鼠骨髓来源的树突状细胞增殖与成熟诱导EL4细胞和JURKATT淋巴细胞的凋亡。为了全面了解ALL对其他免疫细胞的调控作用，本研究以小鼠脾脏来源B细胞、NK92MI细胞为研究对象，观察ALL对其生长的影响，并初步探索其机制，以期对ALL的免疫调控作用有新的认识，为其在临床疾病防治等方面的开发应用奠定良好的理论和实验基础。方法一、ALL对B细胞、NK92MI细胞增殖的影响1、ALL对B细胞增殖的影响无菌条件下取小鼠脾脏，采用EASYSEPTMMOUSEBCELLISOLATIONKIT分离纯化B淋巴细胞，将不同浓度红桂木凝集素溶液分别作用B细胞72H后，倒置显微镜下观察细胞形态，CCK8法检测B细胞的增殖抑制率。2、ALL对NK92MI细胞增殖的影响常规培养人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞NK92MI细胞，NK92MI细胞经不同浓度红桂木凝集素溶液分别作用48H后，倒置显微镜下观察细胞形态，CCK8法检测NK92MI细胞的增殖抑制率FACS检测细胞内功能蛋白GRANZYMEA、GRANZYMEB、GRANULYSIN、PERFORIN的表达。二、ALL受体的初步分析FACS分析ALL与NK92MI细胞的结合FACS分析半乳糖抑制ALL与NK92MI细胞的结合FITCALL与PECD45双染的FACS分析ALL受体与CD45的共定位分析ALL内吞的观察。三、ALL诱导NK92MI细胞凋亡的机制研究常规培养人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞NK92MI细胞，NK92MI细胞经不同浓度红桂木凝集素溶液分别作用24H，ANNEXINⅤ/PI双染检测NK92MI细胞凋亡透射电子显微镜观察凋亡小体PI染色法分析细胞亚二倍体。FACS分析半乳糖对ALL诱导凋亡的抑制作用。荧光定量PCR分析凋亡相关基因的差异表达。FACS检测CASPASE3、CYTOCHROMEC的表达，CASPASE3抑制剂ZDEVDFMK对ALL诱导凋亡的抑制作用。结果一、ALL对B细胞、NK92MI细胞增殖的影响1、ALL抑制B细胞的增殖不同浓度的红桂木凝集素作用B细胞72H后，对照组细胞生长密集，状态良好，随着红桂木凝集素浓度的增加，细胞数量明显逐渐减少，高倍镜下可见细胞透光度降低，细胞皱缩、边缘不整齐，CCK8法检测结果表明细胞的增殖受到显著抑制，呈浓度依赖性，与空白组相比均差异显著。2、ALL抑制NK92MI细胞的增殖不同浓度的红桂木凝集素作用NK92MI细胞48H后，对照组细胞成团生长，状态良好，随着红桂木凝集素浓度的增加，细胞团逐渐变小，高倍镜下可见细胞透光度降低，细胞皱缩、边缘不整齐，CCK8法检测结果表明细胞的增殖受到显著抑制，呈浓度依赖性，与空白组相比均差异显著。120ΜG/MLALL作用NK92MI细胞24H后，流式细胞仪检测细胞内GRANZYMEA、GRANZYMEB、GRANULYSIN、PERFORIN的表达，与对照组相比，实验组GRANZYMEA、GRANULYSIN表达偏高，PERFORIN表达偏低，GRANZYMEB表达量相差无异。二、ALL受体的初步分析FACS结果表明ALL可结合于NK92MI细胞表面，GAL可减弱其结合能力，提示ALL通过细胞表面的糖基而结合于NK92MI细胞，NK92MI细胞、B细胞经FITCALL和PECD45双染后，FACS分析显示，双阳性细胞比例分别达997％、976％。NK92MI细胞、小鼠脾脏B细胞、人外周血T细胞经FITCALL、PECD45双染后，激光共聚焦分析显示ALL受体与CD45分子共定位于细胞膜，提示CD45分子可能是ALL在免疫细胞表面的受体之一。FITCALL作用于NK92MI细胞不同时间后，激光共聚焦分析发现随着时间的延长，ALL内吞现象越明显，提示ALL可能通过与NK92MI细胞表面CD45分子的糖基结合，进入细胞内发挥作用。三、ALL诱导NK92MI细胞凋亡的机制研究不同浓度红桂木凝集素0ΜG/ML、60ΜG/ML、120ΜG/ML分别作用于NK92MI细胞24H后，流式结果表明，各作用浓度的细胞凋亡率与空白对照组相比均有所增加，且随着浓度的增加，细胞的凋亡越明显，细胞凋亡率变化呈浓度依赖性趋势。进一步用透射电子显微镜检测了120UG/MLALL作用24H后的NK92MI细胞，发现对照组细胞呈现正常的细胞质、细胞器、细胞核形态，ALL处理组明显可见细胞核碎裂形成的染色质块，可见球形凋亡小体。PI染色法检测亚二倍体，结果发现，空白对照组NK92MI细胞的SUBG1峰所占比例为1741％，ALL处理组SUBG1峰所占比例为5774％，表明ALL可显著诱导NK92MI细胞的凋亡。FACS分析显示半乳糖处理组NK92MI细胞凋亡率明显减少，差异有统计学意义，表明半乳糖可竞争性抑制ALL诱导的NK92MI细胞凋亡。荧光定量PCR结果显示，120UG/MLALL处理组与对照组相比，细胞内凋亡相关基因BCL2、BCLXL、BAX表达下调，但下调抗凋亡基因BCL2、BCLXL作用更明显。120ΜG/MLALL作用NK92MI细胞24H后，流式细胞仪检测细胞内CASPASE3、CYTOCHROMEC的表达，结果显示CASPASE3、CYTOCHROMEC的表达均无显著差异。CASPASE3抑制剂ZDEVDFMK组凋亡率为506％，ZFAFMK对照组凋亡率为479％，2组之间凋亡率无显著性差异，提示CASPASE3抑制剂不能抑制ALL诱导的凋亡作用。结论一、ALL能够抑制B细胞、NK92MI细胞的生长二、CD45分子可能是ALL在免疫细胞表面的受体之一三、ALL通过进入胞内，下调抗凋亡基因BCL2、BCLXL的表达诱导NK92MI细胞凋亡